Autores:
Gustavo Mendonça
Daniela Baccelli Silveira Mendonça
Maria Angélica Rehder Araújo
Wagner Rodrigues Duarte
Lyndon F. Cooper
Francisco J. L Aragão

RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar uma superfície de implante dentário compatível biologicamente e que aumente a resposta celular de osteoblastos de maneira a estimular o processo de diferenciação do tecido ósseo. Neste estudo foram utilizados discos de titânio comercialmente puro (cpTi) grau IV (6,0 mm x 1,0 mm) divididos em três grupos. Estes discos foram somente usinados (grupo U) ou usinados e subsequentemente tratados com ataque ácido (grupo Ac) ou usinado, jateamento e ataque ácido (grupo J/Ac). Células mesenquimais humanas indiferenciadas foram cultivadas sobre os discos e diferenciadas em osteoblastos. Os níveis de expressão de genes relacionados à diferenciação do tecido ósseo (Fostatase Alcalina–ALP; Sialoproteína Óssea–BSP; e Runx2) foram avaliados após sete e 21 dias através de PCR-tempo real (o gene GAPDH foi utilizado como controle endógeno). Após 35 dias avaliou-se a formação de nódulos de mineralização corados com Alizarin Red S. Observou-se um aumento relativo nos níveis de expressão dos genes ALP, BSP e Runx2 para a superfície com J/Ac quando comparada com as superfícies U e Ac. Após 21 dias a expressão de ALP estava 80 vezes maior na superfície J/Ac e o aumento no nível de BSP foi de 25 vezes. Após 35 dias a área mineralizada foi de 18%, 71% e 80%, para as superfícies U, Ac e J/Ac, respectivamente. Estes resultados sugerem que o jateamento da superfície previamente ao ataque ácido permitiu um maior nível de expressão de genes relacionados à cascata de diferenciação do tecido ósseo e formação de nódulos de mineralização in vitro, podendo levar a uma maior e melhor resposta de osseointegração destas superfícies.
Unitermos – Jateamento; Ataque ácido; Implante dentário; Expressão gênica; Fosfatase alcalina, sialoproteína óssea, Runx2, osteoblastos, células-tronco mesenquimais humanas.

ABSTRACT

Novel implant surfaces have been developed to improve/accelerate the osseointegration process. The mechanism by which implant surface improves osteoblast response at endosseous titanium implants is not fully understood. One of the mechanisms is related to induction of expression of bone-tissue specific genes inducing cells to differentiate into osteoblasts. The aim of this study was to evaluate a biologically compatible implant surface that can improve osteoblast responses and leads to a faster osseointegration. Commercially pure grade IV titanium disks (6.0x1.0mm) were machined (U) or machined acid etching (Ac) or sandblasted/acid etching (J/Ac), and divided into three groups. Human Mesenchymal Stem Cells were plated onto the disks and differentiated into osteoblasts. The expression levels of osteoblast-specific genes were evaluated by Real Time PCR to measure the mRNA levels of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), and Runx2 after 7 and 21 days. The housekeeping gene GAPDH was used as a control. At 35 days, mineralization nodules were evaluated by Alizarin Red S staining. After 21 days, the expression levels of ALP for J/Ac and BSP were upregulated 80-fold and 25-fold, respectively. After 35 days, the mineralized area U, Ac and J/Ac was 18%, 71%, and 80%, for, respectively. The results demonstrated that a sandblasted/acid etched surface can affect adherent cell-bone specific gene expression, leading to a higher expression of osteoblast-specific genes and an increased in vitro mineralization response.

Introdução

Atualmente, apesar da baixa taxa de implantes perdidos (em torno de 5% nos primeiros cinco anos e 15% em quinze anos), as causas estão sem uma resposta comprovada cientificamente1-5. Acredita-se que o implante é perdido precocemente quando há um aquecimento exagerado do tecido ósseo durante sua instalação ou então a prótese provisória sobre este implante em osseointegração não foi devidamente aliviada1,4-5. Novas superfícies de implantes têm sido desenvolvidas com o intuito de melhorar / acelerar o processo de osseointegração. Sabe-se atualmente que a superfície do implante osseointegrado desempenha um papel crucial no contato e na manutenção da ligação entre implante e osso6-7. Entretanto, o mecanismo pelo qual estas superfícies influenciam a resposta do tecido ósseo continua relativamente sem explicação. Um dos mecanismos pelo qual as superfícies dos implantes osseointegrados atuam sobre as células ósseas é através da indução de expressão de genes relacionados à cascata de diferenciação do tecido ósseo8-9. Desta maneira, as células indiferenciadas migram para a superfície do implante e são estimuladas a se diferenciarem em osteoblasto.

Vários trabalhos têm buscado maneiras de melhorar a superfície do implante de modo a otimizar a adesão, proliferação e diferenciação celular de osteoblastos, reduzindo assim o tempo de início da síntese de matriz óssea e a união aos implantes osseointegrados e com isso reduzir o tempo de tratamento e aumentar ainda mais a longevidade dos implantes osseointegrados6-7,10-13.

Para melhorar a performance e assim aumentar o sucesso dos implantes é essencial o desenvolvimento de superfícies com características que se relacionem otimamente com proteínas específicas e subsequentemente com as células ósseas pertinentes. Isto é, imediatamente após a instalação do implante, proteínas serão adsorvidas do plasma para a superfície do material, controlando assim a adesão celular e regeneração tecidual. Esta imediata interação poderia evitar a perda óssea que ocorre mesmo quando os implantes são instalados em alvéolos de extração imediata14. As interações iniciais das proteínas que irão mediar a adesão celular dependem de muitas propriedades dos biomateriais, incluindo composição química, carga, tensão superficial e topografia. A proposta deste trabalho foi avaliar uma superfície de implante osseointegrado compatível biologicamente e que aumente a resposta celular de osteoblastos, comparando estes resultados com outras superfícies de implantes.

Material e Métodos

Preparo dos discos

Discos de titânio comercialmente puro grau IV com dimensões de 6,0 mm de diâmetro x 1,0 mm de espessura foram confeccionados em torno CNC. Após a usinagem um terço dos discos foi submetido ao processo de tratamento ácido (Neodent Implante Osteointegrável, Curitiba/PR). Outro grupo (1/3) foi submetido previamente a jateamento com óxido de alumínio e posteriormente ao processo de tratamento ácido (Neodent Implante Osteointegrável, Curitiba/PR). Os discos foram divididos em três grupos: usinado (U), ataque ácido (Ac) e jateamento seguido de ataque ácido (J/Ac).

Cultura de células

Células mesenquimais humanas (Lonza, EUA) foram adquiridas para utilização neste estudo e mantidas em D-Modified Eagle’s Media (D-MEM) (Invitrogen, Carlsbad/ CA, EUA) e suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) (Invitrogen) e 1x Antibiótico (Invitrogen). Ao atingirem 80% de confluência em placas de 150 mm, as células foram descoladas com solução de trypsina-EDTA (Invitrogen) e semeadas sobre os discos de titânio. Foram colocadas 50.000 células por disco, 50 μl de meio D-MEM. As células foram deixadas em contato com os discos durante quatro horas antes da colocação de novo meio. Após a fixação inicial das células foi adicionado meio de cultura adicional para cobrir totalmente o disco (aproximadamente 200 μl). A indução da diferenciação em osteoblastos foi iniciada 24 horas após o cultivo das células sobre os discos, trocando o meio de cultura pelo meio de diferenciação, contendo 10-7M dexametasona (Invitrogen), 50 nM ácido ascórbico (Invitrogen) e 2,5 μM beta-glicerofosfato (Invitrogen). As células foram cultivadas por um período de até 35 dias. Após esse período, as células foram lisadas para isolar RNA (após sete e 21 dias) para análise molecular da expressão de genes ósseos. Ou coradas para verificar a formação de nódulos de mineralização (após 35 dias).

Extração e análise de RNA

Para a análise molecular, os discos foram colocados em placas de cultura com seis poços. Seis discos foram utilizados para cada período de expressão e o experimento foi realizado com três amostras por grupo. Os períodos de avaliação da expressão gênica foram sete e 21 dias após o início da diferenciação celular.

Para avaliação do nível de expressão de RNA mensageiro (mRNA) nas células aderidas aos discos de titânio, após o período de cultura selecionado, os discos foram removidos do meio de cultura e lavados duas vezes com solução tampão de fosfato (PBS). As células aderentes em cada disco foram lisadas com Trizol (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante e coletadas em precipitação com etanol. O RNA total foi quantificado utilizando UV espectrofotometria. Para cada amostra de RNA (n=3) foi obtido o cDNA utilizando 1,0 μg do RNA total. cDNA foi obtido utilizando o kit SuperScript II (Invitrogen) de acordo com a recomendação do fabricante para uma reação padrão

de 20,0μl. Foi realizado real time PCR para avaliação dos níveis de expressão dos mRNAs para os genes fosfatase alcalina (ALP) sialoproteína óssea (BSP) e Runx2. Volumes iguais de cDNA foram utilizados para preparar todas as reações de PCR. As reações foram preparadas utilizando o kit TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems/CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante em um termociclador ABI 7000 para Real time PCR (Applied Biosystems). A expressão relativa do mRNA foi determinada pelo método 2-����Ct e expressa como nível relativo de expressão. Todas as reações foram normalizadas de acordo com a expressão do gene GAPDH.

Mineralização

Após 35 dias, o meio de cultura dos poços contendo os discos de Ti foram removidos, os poços lavados três vezes com PBS à 37oC e fixados com formalina 4%. Em seguida, os discos de Ti foram desidratados em série crescente de álcoois, como se segue: álcool 30% (uma hora) - álcool 30% (uma hora)- álcool 50% (uma hora) - álcool 50% (uma hora) - álcool 70% (overnight)- álcool 95% (uma – duas horas) - álcool 95% (uma – duas horas) - álcool 100% (uma hora) - álcool 100% (uma hora). Após a desidratação, os discos de Ti foram corados com Alizarin red S (Sigma), que colore em vermelho os nódulos de mineralização ricos em cálcio. Os discos foram fotografados e as imagens obtidas processadas em um programa de imagens (Image Tool for Windows, versão 2.02, University of Texas Health Science Center, San Antonio/TX, EUA). Foi calculada a porcentagem da área total dos discos que apresentaram formação de matriz mineralizada. Neste trabalho foram utilizadas apenas duas amostras de cada superfície para a mineralização e, portanto, não foi realizada a análise estatística.

Resultados

Análise da expressão gênica

O padrão de expressão dos genes foi obtido e serão apresentados como mudanças relativas no nível de expressão comparados à superfície usinada sete dias.

Os níveis de expressão do gene ALP (fosfatase alcalina), medidos pela produção de seu mRNA apresentou-se bastante elevado para o grupo jateamento/ataque ácido com um nível de expressão 3,1 vezes maior após sete dias e 83,0 vezes após 21 dias, comparados com a superfície usinada (Figura 1). A superfície com ataque ácido não apresentou diferenças nos níveis de expressão deste gene, quando comparados à superfície usinada (Figura 1).

Os níveis relativos de expressão do mRNA do gene BSP (sialoproteína óssea) após sete dias são baixos, pois as células ainda não estão produzindo matriz mineralizada. Entretanto, após 21 dias os níveis de expressão apresentaram uma indução de 25,0 vezes comparados com a superfície usinada (Figura 2). A superfície com ataque ácido não apresentou diferenças nos níveis de expressão deste gene, quando comparados à superfície usinada (Figura 2).

A expressão relativa do gene Runx2, após sete dias, apresentou uma indução de 4,5 vezes maior que o grupo controle (usinado), enquanto a superfície com ataque ácido apresentou um aumento na indução de 2,5 vezes (Figura 3). Após 21 dias, o nível de expressão do gene Runx2 apresentou uma indução de aproximadamente 2,0 vezes para a superfície jateamento/ataque ácido quando comparado à superfície usinada sete dias (Figura 3). Após 21 dias, as superfícies usinada e ataque ácido apresentram diminuição no nível de expressão do Runx2 comparados ao usinado sete dias, enquanto a superfície jateamento/ataque ácido apresentou ainda um aumento de 2,0 vezes comparado ao controle (Figura 3). A superfície jateamento/ataque ácido apresentou um aumento da 11,5 vezes e 9,5 vezes no nível de expressão do gene Runx2 quando comparada à superfície usinada e superfície de ataque ácido 21 dias, respectivamente (Figura 4).

Mineralização

Após 35 dias, os discos foram corados com Alizarin Red S para detecção de nódulos de mineralização. A superfície com tratamento de jateamento/ataque ácido apresentou maior porcentagem de mineralização (80%) quando comparada com as superfícies usinadas (18%) e ataque ácido (71%), Figuras 5 e 6.

Discussão

Os efeitos da topografia da superfície na resposta celular, tais como, diferenciação e mineralização, têm sido investigados em vários estudos in vitro e também in vivo6-10. O mecanismo pelo qual a superfície do implante atua na resposta de osseointegração não está ainda completamente elucidado. Os modelos in vitro para o estudo dos efeitos de novas superfícies de implantes permitem uma análise da resposta específica de células controladas sobre o material de estudo. Neste estudo foram utilizadas células mesenquimais humanas indiferenciadas. Este tipo de célula é apta a se diferenciar em células do tecido ósseo, cartilaginoso ou adiposo, quando devidamente estimulada para uma destas três vias. Após um período de expansão, estas células foram colocadas sobre os discos e diferenciadas na via osteogênica (esta diferenciação foi comprovada via PCR). Este modelo in vitro permite avaliar os efeitos das superfícies na expressão gênica e na diferenciação destas células na linhagem de escolha (osteogênica). Após a indução da diferenciação, a expressão de genes específicos como Runx2 induzem a diferenciação de novas células. Os dados in vitro de análise molecular e mineralização, comparados à superfície lisa e com ataque ácido, sugerem que a utilização de jateamento seguido de ataque ácido influenciam uma maior diferenciação e expressão de genes específicos da cascata de diferenciação do tecido ósseo.

A superfície tratada com jateamento/ataque ácido apresentou uma resposta aumentada nos níveis de expressão dos genes ALP, BSP e Runx2. Um aumento no nível de expressão do gene Runx2 indica um aumento na diferenciação de osteoblastos15. Este aumento na diferenciação é confirmado pelo aumento da expressão do gene ALP, que é um gene marcador do início do processo de diferenciação de osteoblastos. E é também confirmada pelo aumento nos níveis de BSP, que é um gene tardio de osteoblastos e característico do início da deposição de matriz mineralizada16.

Como resposta ao aumento da expressão destes genes, após 35 dias de cultura, também foi possível observar uma maior área de nódulos de mineralização sobre a superfície dos discos tratados com jateamento/ataque ácido, indicando uma maior atividade de osteoblastos em relação às demais superfícies (Figuras 5 e 6).

Os níveis elevados de Runx2 influenciam a expressão de outros genes relacionados à diferenciação de osteoblastos, tais como, Fosfatase alcalina, Colágeno tipo I, Osteocalcina e Osteopontina17. Este aumento na expressão de Runx2 pode ser uma resposta específica da topografia da superfície sobre a célula aderida. Outros estudos também apresentaram expressão aumentada de Runx2 em superfícies com topografia ativada8-9. Os níveis elevados de expressão gênica observados neste estudo refletem também o que foi observado em outros estudos, quando comparam superfícies ativadas comparadas às superfícies de implantes apenas usinadas6-9,12-13. Entretanto, estudos de longo prazo também são necessários para verificar o real desempenho e benefício de novas superfícies de implantes osseointegrados.

Conclusão

Baseado nas limitações deste trabalho, foi possível observar in vitro uma resposta positiva da superfície tratada com jateamento seguido de ataque ácido para modular a resposta de células mesenquimais humanas na diferenciação em osteoblastos. Uma maior expressão de genes relacionados com a cascata de diferenciação do tecido ósseo foi observada em células cultivadas sobre a superfície com jateamento/ataque ácido, associado com uma maior porcentagem de área mineralizada.

Recebido em out/2008
Aprovado em jan/2009

Agradecimentos: Os autores agradecem a Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e a Neodent Implante Osteointegrável (Curitiba/PR) pelo apoio dado a este projeto através de bolsa de doutorado Sandwich e Pesquisa.

Endereço para correspondência: Gustavo Mendonça Universidade Católica de Brasília - UCB - Curso de Odontologia QS 07, Lote 1 - Bloco “S”, Sala S-213, EPCT - Águas Claras 71966-700 - Taguatinga - DF Telefax: (61) 3356-9612 gmendonca@ufu.br mendonca@ucb.br

Referências

1. Adell R, Eriksson B, Lekholm U, Branemark PI, Jemt T. Long-term follow-up study of osseointegrated implants in the treatment of totally edentulous jaws. Int J Oral Maxillofac Implants 1990;5:347-59.

2. Albrektsson T, Dahl E, Enbom L, Engevall S, Engquist B, Eriksson AR et al. Osseointegrated oral implants. A Swedish multicenter study of 8139 consecutively inserted Nobelpharma implants. J Periodontol 1988;59:287-96.

3. Goodacre CJ, Kan JY, Rungcharassaeng K. Clinical complications of osseointegrated implants. J Prosthet Dent 1999;81: 537-52.

4. Mendonça G, Lira T, Fernandes Neto AJ, Neves FD. Avaliação longitudinal de próteses sobreimplantes enfatizando dificuldades e insucessos – Controle de um ano. BCI 2001;8(31):228-35. 5. Zarb GA, Schmitt A. The longitudinal clinical effectiveness of osseointegrated dental implants: the Toronto study. Part III: Problems and complications encountered. J Prosthet Dent 1990;64:185-94.

6. Buser D, Broggini N, Wieland M, Schenk RK, Denzer AJ, Cochran DL et al. Enhanced bone apposition to a chemically modified SLA titanium surface. J Dent Res 2004;83:529-33.

7. Ellingsen JE, Johansson CB, Wennerberg A, Holmen A. Improved retention and bone-to-lmplant contact with fluoride-modified titanium implants. Int J Oral Maxillofac Implants 2004;19:659-66.

8. Guo J, Padilla RJ, Ambrose W, De Kok IJ, Cooper LF. Modification of TiO2 grit blasted titanium implants by hydrofluoric acid treatment alters adherent osteoblast gene expression in vitro and in vivo. Biomaterials 2007;28:5418-25.

9. Isa ZM, Schneider GB, Zaharias R, Seabold D, Stanford CM. Effects of fluoridemodified titanium surfaces on osteoblast proliferation and gene expression. Int J Oral Maxillofac Implants 2006;21:203-11.

10. Gutwein LG, Webster TJ. Increased viable osteoblast density in the presence of nanophase compared to conventional alumina and titania particles. Biomaterials 2004;25:4175-83.

11. Oh SH, Finones RR, Daraio C, Chen LH, Jin S. Growth of nano-scale hydroxyapatite using chemically treated titanium oxide nanotubes. Biomaterials 2005;26:4938-43. 12. Schwartz Z, Nasazky E, Boyan BD. Surface microtopography regulates osteointegration: the role of implant surface microtopography in osteointegration. Alpha Omegan 2005;98:9-19.

13. Zhao G, Schwartz Z, Wieland M, Rupp F, Geis-Gerstorfer J, Cochran DL et al. High surface energy enhances cell response to titanium substrate microstructure. J Biomed Mater Res A 2005;74:49-58.

14. Araújo MG, Sukekava F, Wennström JL, Lindhe J. Ridge alterations following implant placement in fresh extraction sockets: an experimental study in the dog. J Clin Periodontol 2005;32:645-52.

15. Harada S, Rodan GA. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature 2003; 15;423:349-55.

16. Cooper LF, Yliheikkila PK, Felton DA, Whitson SW. Spatiotemporal assessment of fetal bovine osteoblast culture differentiation indicates a role for BSP in promoting differentiation. J Bone Miner Res 1998;13:620-32.

17. Harada H, Tagashira S, Fujiwara M, Ogawa S, Katsumata T, Yamaguchi A et al. Cbfa1 isoforms exert functional differences in osteoblast differentiation. J Biol Chem 1999 12;274:6972-8.